Hướng dẫn chuẩn bị pha động HPLC: chọn dung môi, pha đệm, lọc màng, khử khí và bảo quản để hệ sắc ký ổn định, giảm nhiễu nền và bảo vệ cột.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha động thường bị xem là phần “đơn giản” nhất, nhưng lại là nguồn gốc của rất nhiều sự cố: nền nhiễu, bọt khí trong detector, áp suất dao động, thời gian lưu trôi hoặc cột nhanh xuống cấp. Một quy trình chuẩn bị pha động bài bản giúp phương pháp ổn định và dữ liệu đáng tin cậy hơn. Bài viết tổng hợp những bước quan trọng nhất trong phòng thí nghiệm.
1. Chọn dung môi và nước đúng cấp độ
Dung môi hữu cơ (acetonitrile, methanol…) nên dùng loại dành riêng cho HPLC hoặc LC-MS; với phương pháp phát hiện UV ở bước sóng thấp hoặc khối phổ, tạp chất vết trong dung môi sẽ hiện ngay trên đường nền. Nước dùng pha động cần là nước siêu sạch (thường là nước loại 1 theo ISO 3696) và nên lấy mới, tránh nước để lâu trong bình chứa vì dễ nhiễm vi sinh và chất hữu cơ hòa tan.
Các phụ gia như axit formic, axit trifluoroacetic, amoni acetat, muối phosphat cũng cần chọn cấp tinh khiết phù hợp. Với LC-MS, ưu tiên phụ gia bay hơi; không dùng phosphat vì sẽ đóng cặn trong nguồn ion hóa.
2. Pha dung dịch đệm: thứ tự thao tác quan trọng
- Cân và hòa tan muối đệm hoàn toàn trong pha nước trước khi trộn với dung môi hữu cơ.
- Đo và chỉnh pH của pha nước trước khi thêm dung môi hữu cơ. Điện cực pH không cho giá trị chính xác trong hỗn hợp có nhiều dung môi hữu cơ.
- Hiệu chuẩn pH-meter bằng dung dịch chuẩn đệm trước khi dùng.
- Đo thể tích từng thành phần bằng ống đong hoặc bình định mức riêng, rồi mới trộn, vì thể tích sau khi trộn nước và dung môi hữu cơ có thể co lại.
- Ghi rõ công thức pha (tỉ lệ theo thể tích, nồng độ đệm, pH) trong sổ phòng thí nghiệm.
Cần lưu ý nồng độ muối đệm không quá cao khi dùng với tỉ lệ dung môi hữu cơ lớn, vì muối có thể kết tủa trong bơm, van hoặc cột. Khi chạy gradient lên nồng độ hữu cơ cao, nên kiểm tra độ tan của đệm trong toàn dải gradient.
3. Lọc pha động
Lọc loại bỏ hạt rắn và vi sinh có thể làm tắc frit, van một chiều hoặc đầu cột. Thông lệ phổ biến là dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm cho HPLC thông thường và 0,22 µm cho hệ UHPLC hoặc cột có hạt nhỏ; hãy đối chiếu với khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị và cột. Chất liệu màng phải tương thích với dung môi:
| Loại màng | Phù hợp với |
| Nylon | Dung dịch nước và nhiều dung môi hữu cơ thông dụng |
| PTFE | Dung môi hữu cơ; dòng ưa nước cần làm ướt trước |
| PVDF | Dung dịch nước và hỗn hợp nước – hữu cơ |
| Cellulose tái sinh (RC) | Cả pha nước và nhiều dung môi hữu cơ |
Chỉ cần lọc pha nước hoặc pha có chứa muối; dung môi HPLC nguyên chai đã được lọc tại nhà máy và thường không cần lọc lại. Dụng cụ lọc nên được tráng bằng chính dung môi sẽ lọc để tránh nhiễm chéo.
4. Khử khí (degassing)
Khí hòa tan thoát ra khi pha động giảm áp sau cột sẽ tạo bọt, gây nhiễu nền, đỉnh giả và dao động lưu lượng. Một số cách khử khí thường gặp:
- Bộ khử khí trực tuyến (in-line degasser): tiện và hiệu quả, là cấu hình sẵn có trên đa số hệ HPLC hiện nay.
- Lọc chân không: vừa lọc vừa loại bớt khí, dễ kết hợp với bước lọc.
- Siêu âm: đơn giản, phù hợp khi thiếu thiết bị; thời gian ngắn, tránh làm nóng và bay hơi dung môi làm lệch tỉ lệ pha.
- Sục khí helium: hiệu quả cao nhưng tốn khí, thường dùng cho hệ cũ hoặc phương pháp nhạy.
5. Bảo quản và thời hạn sử dụng
Pha động có nước, đặc biệt là đệm gần trung tính, là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Nên pha lượng vừa đủ dùng, dùng bình thủy tinh sạch, đậy kín và tránh ánh sáng nếu phương pháp yêu cầu. Quy định thời hạn dùng của pha động trong quy trình nội bộ, và bỏ đi khi có dấu hiệu đục hoặc lắng cặn. Không châm thêm pha động mới vào bình còn dư; hãy tráng và thay bình mới.
Sau khi chạy xong, rửa hệ thống và cột bằng hỗn hợp nước – dung môi hữu cơ không chứa muối để tránh kết tinh đệm khi dừng máy. Dán nhãn bình pha động đầy đủ: thành phần, ngày pha, người pha, để truy vết khi có kết quả bất thường.
Tóm tắt nhanh
Dung môi và nước đạt cấp độ phù hợp, chỉnh pH trước khi trộn hữu cơ, lọc phần có muối, khử khí và pha mới thường xuyên là bốn thói quen giúp hệ HPLC vận hành ổn định. Nếu quý khách cần tư vấn về dung môi HPLC, chất chuẩn, màng lọc hay vật tư cho phòng phân tích, hãy liên hệ Tam Hưng Long qua Hotline/Zalo 0916 999 013 để được hỗ trợ.
